本試劑為4％多聚甲醛，由0.1M PB溶解。未經(jīng)DEPC處理。

本試劑為-20度保存，如果經(jīng)常使用，可放2-8度。解凍后，混勻使用。

關(guān)于固定方法與時(shí)間，以及適合標(biāo)本，請(qǐng)自行參考文獻(xiàn)。

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不同固定方法對(duì)新生大鼠腦組織切片的影響

【摘要】  目的：觀察應(yīng)用與不應(yīng)用多聚甲醛心臟灌注這兩種不同固定方法對(duì)新生大鼠腦組織切片的影響。方法：20只新生大鼠隨機(jī)化分為灌注組與非灌注組，每組各10只。灌注組經(jīng)麻醉后經(jīng)左心室插入灌流針，先灌注冰凍無(wú)菌生理鹽水再灌注4％多聚甲醛，灌注同時(shí)切開(kāi)小部分肝臟，斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時(shí)，再經(jīng)70％、80％、95％、100％乙醇及二甲苯浸泡，石蠟包埋。非灌注組新生大鼠經(jīng)麻醉后直接斷頭取腦，其它固定方法同灌注組。進(jìn)行石蠟切片HE染色觀察鼠腦組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果：灌注組腦組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)共染現(xiàn)象, 組織切片完整均勻，皮層及海馬區(qū)組織、細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)擴(kuò)張的毛細(xì)血管。非灌注組大腦皮層及海馬區(qū)組織水腫，細(xì)胞周?chē)g隙增寬，胞體腫脹，有些細(xì)胞邊界模糊不清，核著色不良，部分視野可見(jiàn)擴(kuò)張的毛細(xì)血管，血管內(nèi)有血細(xì)胞樣物。結(jié)論：應(yīng)用多聚甲醛心臟灌注對(duì)新生大鼠腦組織的固定效果較好，是應(yīng)用動(dòng)物腦組織切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)的*的步驟。

【關(guān)鍵詞】  新生大鼠 大腦 組織固定 組織切片

    新生大鼠腦組織切片是觀察新生大鼠腦組織病理?yè)p傷的主要實(shí)驗(yàn)方法之一。在進(jìn)行腦組織切片之前，需對(duì)處死的新生大鼠鼠腦進(jìn)行固定。有文獻(xiàn)表述直接把處死的鼠腦浸泡在4％多聚甲醛溶液中固定，也有文獻(xiàn)介紹應(yīng)用在體心臟灌流術(shù)經(jīng)心臟灌注4％多聚甲醛后再浸泡固定方法［1］。為對(duì)比這兩種方法對(duì)新生大鼠腦組織切片的影響，我們?cè)谶M(jìn)行新生大鼠實(shí)驗(yàn)中分別應(yīng)用這兩種方法，觀察直接固定與在體心臟灌流術(shù)后固定對(duì)新生大鼠腦組織切片的影響。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料 

　　多聚甲醛由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，4%多聚甲醛臨用前配制，配制后過(guò)濾去除小的雜質(zhì)，配制后放置到冰箱中，冷卻到4 ℃后使用。Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)及Olympus CHC-212生物顯微鏡為日本公司生產(chǎn)。

　　1.2  動(dòng)物分組 

　　7日齡新生SD大鼠性別不限，體重10～15 g，共20只，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)化分為灌注組與非灌注組，每組各10只。

　　1.3  新生大鼠大腦組織固定與樣本準(zhǔn)備 

　　灌注組新生大鼠經(jīng)乙mi吸入麻醉后固定于自制的手術(shù)木板上，置于解剖盤(pán)中，開(kāi)胸暴露并游離出心臟，切開(kāi)右心房，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，灌注同時(shí)切開(kāi)小部分肝臟，先灌注冰凍無(wú)菌生理鹽水（4 ℃）30～50 mL直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清，后再灌注冰凍（4 ℃）4％多聚甲醛30～50 mL，斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時(shí)，再經(jīng)70％、80％、95％、100％乙醇及二甲苯浸泡，石蠟包埋。非灌注組新生大鼠經(jīng)乙mi吸入麻醉后直接斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時(shí)，其它固定方法同灌注組。

　　1.4  樣本切片與HE染色 

　　切片自視交叉冠狀平面開(kāi)始，切至出現(xiàn)海馬結(jié)構(gòu)，片厚5 μm，每隔5張取1張，每個(gè)標(biāo)本取10張，黏于多聚賴氨酸處理后的切片上，進(jìn)行HE染色觀察鼠腦組織結(jié)構(gòu)。每張腦切片取左側(cè)顳頂葉皮層及左側(cè)海馬CA1區(qū)中段隨機(jī)各取6個(gè)視野拍照。

　　2  結(jié)果

    灌注組應(yīng)用4%多聚甲醛灌注過(guò)程中觀察到新生大鼠四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬、全身強(qiáng)直現(xiàn)象。灌注組新生大鼠大腦組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核染色鮮艷，核無(wú)明顯腫脹，核漿對(duì)比度好，無(wú)共染現(xiàn)象, 組織切片更加完整均勻，鏡下與石蠟切片相似，皮層及海馬區(qū)組織、細(xì)胞形態(tài)正常。未見(jiàn)擴(kuò)張的毛細(xì)血管。見(jiàn)圖1、圖2。非灌注組新生大鼠大腦皮層及海馬區(qū)組織水腫，細(xì)胞周?chē)g隙增寬，胞體腫脹，有些細(xì)胞邊界模糊不清，細(xì)胞核著色不均，部分視野可見(jiàn)擴(kuò)張的毛細(xì)血管，血管內(nèi)有血細(xì)胞樣物。見(jiàn)圖3、圖4。
  
　　3  討論

    病理標(biāo)本的制作和組織切片都必須先進(jìn)行固定。如果固定不佳，制片的其它程序?qū)踪M(fèi)時(shí)間，沒(méi)有很好的固定，HE染色就難以進(jìn)行。新生大鼠腦組織切片常用于對(duì)新生大鼠腦形態(tài)學(xué)影響的研究，比如免疫組化、細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)。組織的固定是形態(tài)學(xué)研究中*的重要步驟。組織的固定有以下作用：抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的釋放和活性，防止自溶；抑制組織中細(xì)菌的繁殖，防止組織腐壞，使細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂肪、糖等各種成分凝固成不溶性物質(zhì)，以防止物質(zhì)擴(kuò)散并維持原有的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)； 固定后的組織對(duì)染料有不同的親和力，染色后可產(chǎn)生不同的折射率，顏色更為清晰鮮明，便于觀察，硬化組織，便于切片［2］。還可將抗原固定在原位，保持其抗原性，使抗原能準(zhǔn)確可靠地顯示出來(lái)［3］。在進(jìn)行動(dòng)物腦實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的固定劑中，zui常用的是多聚甲醛［4，5］。有研究認(rèn)為應(yīng)用4%的多聚甲醛磷酸緩沖液固定效果［6］。

    我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用4％多聚甲醛心臟灌注及腦標(biāo)本浸泡對(duì)新生大鼠腦組織的固定效果較好，組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰完整，染色滿意。而不用4％多聚甲醛心臟灌注僅腦標(biāo)本浸泡固定的效果就相對(duì)較差，組織水腫，細(xì)胞周?chē)g隙增寬，胞體腫脹，有些細(xì)胞邊界模糊不清，染色欠滿意。說(shuō)明應(yīng)用4％多聚甲醛心臟灌注這一步驟*。我們分析認(rèn)為應(yīng)用4％多聚甲醛心臟灌注可能有如下作用：①標(biāo)本血管沖洗，減少血管內(nèi)血液有形成分存留，影響切片形態(tài)學(xué)觀察。②多聚甲醛經(jīng)毛細(xì)血管快速滲入組織中起固定作用。而不進(jìn)行心臟灌注僅僅標(biāo)本浸泡，多聚甲醛可能要經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間才能滲入組織中起固定作用。尤其固定較大的標(biāo)本時(shí)固定劑需更長(zhǎng)時(shí)間才能滲入組織中。我們應(yīng)用的新生大鼠腦標(biāo)本遠(yuǎn)較大鼠小。③減少組織細(xì)胞自溶現(xiàn)象。我們實(shí)驗(yàn)未觀察到明顯的細(xì)胞自溶現(xiàn)象。但部分細(xì)胞腫脹，可能由于腦標(biāo)本尚小的原因，不排除對(duì)于較大標(biāo)本會(huì)進(jìn)一步發(fā)生細(xì)胞自溶現(xiàn)象。

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